Harvard Inmersión en la realidad del ARN de las células

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Inmersión en la realidad del ARN de las células

 

Wyss Institute | Wyss Institute at Harvard

 

El nuevo método de detección de ARN altamente sensible, específico y multiplexable avanza en la transcriptómica in situ con potencial para una variedad de aplicaciones biomédicas

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Los investigadores compararon el método BOLORAMIS con el análisis FISH de molécula única(smFISH), un estándar común para los estudios de localización de ARN, al rastrear la ubicación de una molécula de ARN larga no codificante conocida como MALAT1. Mientras que el análisis smFISH detecta MALAT1 en un patrón bastante difuso, BOLORAMIS resuelve los sitios MALAT1 individuales en las células (naranja en las imágenes de la izquierda) como pequeños puntos y muestra que el ARN se lanza entre el citoplasma (arriba) y el núcleo (abajo) en las células. .

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Los núcleos se tiñen de azul en todas las imágenes fluorescentes de la izquierda, mientras que las imágenes de la derecha muestran dónde reside MALAT1 en las estructuras generales de las células. 

(BOSTON) – Las células humanas suelen transcribir la mitad de sus aproximadamente 20.000 genes en moléculas de ARN en un momento dado. Al igual que con las proteínas, la función de esas especies de ARN no solo depende de su abundancia, sino también de su localización precisa dentro del espacio 3D de cada célula.
Muchas moléculas de ARN transportan información genética desde el núcleo de la célula a la maquinaria sintetizadora de proteínas distribuida por todo el citoplasma (ARN mensajero o ARNm)
Otras son componentes de esa maquinaria en sí, mientras que otras aún regulan los genes y su expresión, o tienen funciones que permanecen. por descubrir. Es importante destacar que muchas enfermedades, incluido el cáncer y las enfermedades neurológicas, tienen firmas que aparecen como cambios en la abundancia y distribución de ARN
Para permitir el análisis de la colección completa de ARN de una célula conocida como su transcriptoma en su espacio 3D (transcriptómica espacial), los biólogos sintéticos del Instituto Wyss dirigidos por el miembro de la Facultad Central George Church , Ph.D. en 2014 informó FISSEQ , una tecnología de secuenciación espacial impactante que es capaz de leer simultáneamente las secuencias de miles de esos ARN y visualizar sus coordenadas tridimensionales. Sin embargo, la poderosa capacidad de FISSEQ para secuenciar esta gran cantidad de objetivos de ARN en el lugar tiene un precio: su eficiencia de detección y sensibilidad para muchos de ellos es relativamente baja, especialmente cuando su expresión es baja al principio o cuando se marca una enfermedad.

 

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Ahora, el equipo de Church ha desarrollado un nuevo método de detección de ARN llamado BOLORAMIS (abreviatura de “ B arcoded O ligonucleotides L igated O n R NA A mplified para M ultiplexed y paralela I n S itu análisis”) que supera este problema.

BOLORAMIS permite el diseño y utiliza un nuevo tipo de sonda de ADN que se une directamente a su objetivo de ARN y permite la síntesis directa de un amplicón de ADN con código de barras, que puede visualizarse mediante hibridación fluorescente in situ (FISH) o secuenciarse in situ.. BOLORAMIS permite el análisis de diferentes clases de ARN con mayor especificidad y sensibilidad que FISSEQ y otros métodos, trabaja en el contexto de células y tejidos y puede ser altamente multiplexado. El estudio se publica en Nucleic Acids Research .

“Con BOLORAMIS hemos resuelto algunos de los retos a los que se enfrentan las tecnologías en el campo de la transcriptómica espacial. Nos brinda una ventaja significativa para comprender el comportamiento de las redes moleculares en procesos normales y patológicos, y para investigar nuevos objetivos de fármacos y desarrollar diagnósticos clínicos en el contexto nativo de tejidos que ahora podemos aprovechar ”, dijo Church, quien es el Líder de la plataforma de Biología Sintética del Instituto Wyss y Profesor de Genética en la Escuela de Medicina de Harvard (HMS) y de Ciencias y Tecnología de la Salud en Harvard y MIT.

 

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“La fuerza de BOLORAMIS radica en el hecho de que sus sondas optimizadas tienen una huella muy corta en los ARN, y que elimina la necesidad de generar primero una réplica de ADN de moléculas de ARN en un paso de ‘transcriptasa inversa’, que puede producir resultados y es caro ”, dijo el coautor principal Songlei Liu , un estudiante graduado que trabaja en el equipo de Church.

En FISSEQ, todos los ARN se fijan primero en su lugar y luego la secuencia completa de ARN se copia en su secuencia de ADN complementaria (transcripción inversa), que luego se circulariza y amplifica en bolas más grandes de ADN. Estos pueden secuenciarse y visualizarse bajo un microscopio de fluorescencia especializado. “En BOLORAMIS, al omitir este paso de transcripción inversa y amplificar directamente la señal de ARN, reducimos las señales fluorescentes falsas y no específicas”, dijo Liu.

 

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Las sondas BOLORAMIS se unen como un candado firmemente y con alta especificidad a una pequeña secuencia de solo 25 nucleótidos en una molécula de ARN y, por lo tanto, tienen una huella mucho más pequeña que otros métodos de transcriptómica espacial dirigida, lo que mejora la resolución. Además, las sondas contienen secuencias de códigos de barras que asignan un código postal molecular único a cada especie de ARN objetivo. Tras la hibridación de las sondas del candado con código de barras al ARN, se circularizan y amplifican en un pequeño amplicón en la ubicación del ARN objetivo, sin la necesidad de un paso de transcripción inversa. A continuación, el amplicón puede secuenciarse in situ o localizarse con alta sensibilidad utilizando un segundo tipo de sonda, conocida como fluorescente in situ. Sonda de hibridación (FISH), que reconoce los múltiples códigos de barras contenidos en un solo amplicón.

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Esta imagen muestra la localización de un ARNm que codifica la enzima de mantenimiento GAPDH en todo un organoide cerebral humano. El método BOLORAMIS (izquierda) realizado con una sonda específica de GAPDH muestra un patrón de localización claro, mientras que no produce un patrón significativo con una sonda de control inespecífica. Crédito: Instituto Wyss de la Universidad de Harvard 
El equipo exploró primero las capacidades cuantitativas de BOLORAMIS en células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) cuantificando los niveles de 77 ARNm que codifican una variedad de factores de transcripción y los de 77 ARN no codificantes con otras funciones en la regulación génica. Si bien BOLORAMIS demostró consistentemente una expresión alta y localizada de ARN que se correlaciona con la “madre” en las células, reveló una baja expresión de ARN que promueve la diferenciación. En una línea de células cancerosas, BOLORAMIS pudo rastrear cuantitativamente la ubicación y los movimientos de un ARN no codificante conocido como MALAT1 que viaja entre dos ubicaciones subcelulares diferentes, el núcleo y el citoplasma. Además,

 

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“Para nosotros era de vital importancia poder utilizar BOLORAMIS para el análisis multiplexado de muchos ARN, que esperábamos que permitiera el nuevo diseño de la sonda”, dijo la coautora primera Sukanya Punthambaker , Ph.D., becaria postdoctoral en Equipo de Church. De hecho, un paquete de software desarrollado por el coautor Andrew Pawlowski predice sondas ideales para cualquier secuencia de genes que luego se pueden sintetizar como bibliotecas completas para fines específicos. El equipo ha hecho que esta herramienta esté disponible en el servidor de GitHub . “Usamos un sistema de co-cultivo de células neuronales y microglia cerebral que se sabe que interactúan en muchos procesos normales y patológicos, y nos dirigimos a 96 ARN mensajeros diferentes simultáneamente”, dijo Punthambaker. “Esto nos permitió descubrir las relaciones espaciales entre células específicas y ARN”.

 

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“En investigaciones futuras, la alta funcionalidad de BOLORAMIS en tejidos humanos complejos y organoides específicos para humanos puede darnos una ventaja para descifrar las firmas de ARN relacionadas con trastornos neurológicos”, agregó la científica senior Jenny Tam , Ph.D., coautora del estudia e integra algunas de las actividades de investigación de Church en el Instituto Wyss.

“Evaluar las ubicaciones precisas y los niveles de moléculas de ARN dentro de las células completas con la mayor eficiencia y precisión que proporciona el método BOLORAMIS debería mejorar significativamente nuestra capacidad para comprender cómo la organización de células y tejidos impacta la fisiología normal, así como los estados de enfermedad complejos, y por lo tanto, facilitar el desarrollo. de nuevas terapias y diagnósticos para innumerables aplicaciones ”, dijo el director fundador de Wyss, Donald Ingber , MD, Ph.D., quien también es  profesor de Biología Vascular Judah Folkman  en HMS y Boston Children’s Hospital, y profesor de bioingeniería en Harvard John A Escuela Paulson de Ingeniería y Ciencias Aplicadas.

Con BOLORAMIS hemos resuelto algunos de los retos a los que se enfrentan las tecnologías en el campo de la transcriptómica espacial. Nos brinda una ventaja significativa para comprender el comportamiento de las redes moleculares en procesos normales y patológicos, y para investigar nuevos objetivos farmacológicos y desarrollar diagnósticos clínicos en el contexto nativo de los tejidos que ahora podemos aprovechar.

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